Метод Грама — метод окраски микроорганизмов для исследования, позволяющий дифференцировать бактерии по биохимическим свойствам их клеточной стенки. Предложен в 1884 году датским врачом Гансом Кристианом Грамом.

По Граму бактерии окрашивают анилиновыми красителями — генциановым или метиловым фиолетовым и др., затем краситель фиксируют раствором иода. При последующем промывании окрашенного препарата спиртом те виды бактерий, которые оказываются прочно окрашенными в синий цвет, называют грамположительными бактериями, обозначаются Грам (+), — в отличие от грамотрицательных, Грам (−), которые при промывке обесцвечиваются.

После промывания растворителем при окрашивании по Граму добавляется контрастный красный краситель, который окрашивает все грамотрицательные бактерии в красный или розовый цвет. Это происходит из-за наличия внешней мембраны, препятствующей проникновению красителя внутрь клетки. Тест классифицирует бактерии, разделяя их на две группы относительно строения их клеточной стенки.

Содержание

Использование в диагностике [ править | править код ]

Окраска по Граму имеет большое значение в систематике бактерий, а также для микробиологической диагностики инфекционных заболеваний.

Грамположительны кокковые (кроме представителей рода Neisseria) и спороносные (за исключением Coxiella burnetii) формы бактерий, они окрашиваются в иссиня-чёрный (тёмно-синий) цвет.

Грамотрицательны многие неспороносные бактерии, они окрашиваются в красный или розовый цвет.

Техника проведения окраски [ править | править код ]

Окраска по Граму относится к сложному способу окраски, когда на мазок воздействуют двумя красителями, из которых один является основны́м, а другой — дополнительным. Кроме красящих веществ при сложных способах окраски применяют обесцвечивающие вещества: спирт, кислоты и др.

Для окраски по Граму чаще используют анилиновые красители трифенилметановой группы: генциановый, метиловый фиолетовый или кристаллвиолет. Грамположительные микроорганизмы дают прочное соединение с указанными красителями и йодом. При этом они не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, вследствие чего при дополнительной окраске фуксином грамположительные микроорганизмы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет.

Грамотрицательные микроорганизмы образуют с основными красителями и иодом легко разрушающееся под действием спирта соединение. В результате микробы обесцвечиваются, а затем окрашиваются фуксином, приобретая красный цвет.

Подготовка материала для окраски [ править | править код ]

1. Исследуемый материал распределяют тонким слоем по поверхности хорошо обезжиренного предметного стекла.
2. Приготовленный мазок высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют.
3. Гистологические срезы готовят по стандартной методике, фиксируя кусочки тканей в формалине и заливая в парафин.

Фиксация [ править | править код ]

При фиксировании мазок закрепляется на поверхности предметного стекла, и поэтому при последующей окраске препарата микробные клетки не смываются. Кроме того, убитые микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые.

Различают физический способ фиксации, в основу которого положено воздействие высокой температуры на микробную клетку, и химические способы, предусматривающие применение химических средств, вызывающих коагуляцию белков цитоплазмы.

Физический способ фиксации [ править | править код ]

Предметное стекло с препаратом берут пинцетом или I и II пальцами правой руки за рёбра мазком кверху и плавным движением проводят 2—3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен занимать не более 2 с.

Надёжность фиксации проверяют следующим приёмом: свободную от мазка поверхность предметного стекла прикладывают к тыльной поверхности левой кисти. При правильном фиксировании мазка стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущения ожога (70—80°C).

Химический способ фиксации [ править | править код ]

Для фиксации мазков применяют метиловый спирт, ацетон, смесь Никифорова (смесь этилового спирта 96 % и наркозного эфира в соотношении 1:1), жидкость Карнуа (96-процентного этилового спирта — 60 %, хлороформа — 30 %, ледяной уксусной кислоты — 10 %), спирт-формол (40-процентного формалина — 5 мл, 96-процентного этилового спирта — 95 мл). Предметное стекло с высушенным мазком погружают в склянку с фиксирующим веществом на 10—15 минут и затем высушивают на воздухе. Применяется также фиксация в парах 40-процентного формалина в течение нескольких секунд.

Процесс окрашивания мазков [ править | править код ]

1. На фиксированный мазок наливают один из осно́вных красителей на 2—3 минуты. Во избежание осадков окрашивают через фильтровальную бумагу.
2. Сливают краску, аккуратно удаляют фильтровальную бумагу. Мазок заливают раствором Люголя или йодистым раствором по Граму (водный раствор йодида калия и кристаллического йода в соотношении 2:1) на 1—2 минуты до почернения препарата.
3. Раствор сливают, мазок прополаскивают 96° этиловым спиртом или ацетоном, наливая и сливая его, пока мазок не обесцветится и стекающая жидкость не станет чистой (приблизительно 20—40—60 секунд).
4. Тщательно промывают стекла в проточной или дистиллированной воде 1—2 мин.
5. Для выявления грамотрицательной группы бактерий препараты дополнительно окрашивают фуксином или сафранином (2—5 мин).
6. Промывают в проточной воде и высушивают фильтровальной бумагой.

Техника окраски бактерий в гистологических срезах по Граму-Вейгерту [ править | править код ]

1. Депарафинированные срезы доводят до воды.
2. Окрашивают 20 мин в 1 % растворе парарозанилина или основного фуксина в 1 % уксусной кислоте (раствор красителя нагревают до кипения, охлаждают и фильтруют).
3. Промывают в 3 сменах дистиллированной воды.
4. Окрашивают 5 мин в 1 % кристаллического фиолетового в дистиллированной воде.
5. Быстро ополаскивают в 1 % растворе хлорида натрия.
6. Обрабатывают 30 с в смеси: 1 часть иода + 2 части йодида калия + 100 частей дистиллированной воды.
7. Промокают фильтровальной бумагой.
8. Дифференцируют, нанося на срез смесь равных объёмов анилина и ксилола (1 — 2 мл); растворы сливают до тех пор, пока облачка красителя не перестанут отходить от среза.
9. Проводят через 3 смены ксилола.
10. Заключают в бальзам или любую смолу, растворённую в ксилоле.

Результат: грамположительные бактерии — сине-чёрные, фибрин — фиолетовый, ядра — красные.

Микроскопическое исследование мазков из цервикального канала и отделяемого из влагалища является необходимым методом в скрининге и диагностике инфекционно-воспалительных заболеваний женских половых путей (цервицит, вагинит), поскольку позволяет оценить степень воспалительного процесса (лейкоцитарную реакцию) и состояние микрофлоры, а также выявить элементы грибов рода Candida, трихомонады, внутриклеточные диплококки.

Кроме того, на сегодняшний день бактериоскопия окрашенного по Граму мазка из влагалища — это «золотой стандарт» диагностики бактериального вагиноза. Диагностика бактериального вагиноза основывается на наличии или отсутствии следующих признаков:

• уменьшение количества или исчезновение лактобацилл — грамположительных палочек разной длины и толщины;
• увеличение количества грамвариабельной (смешанной) кокко-бациллярной микрофлоры;
• наличие ключевых клеток, которые представляют собой поверхностные клетки эпителия влагалища с адгезированными на них бактериями, за счет чего эпителиальная клетка имеет зернистый вид, а края таких клеток выглядят нечеткими.

Для оценки результатов исследования препаратов, полученных из отделяемого влагалища и окрашенных по Граму, используется стандартная десятибалльная шкала (критерии Ньюджента), которая была предложена в 1991 году Nugent R.P. и соавторами (Nugent’s Diagnostic Criteria for Bacterial Vaginosis). В основе лежит система баллов (очков) от 0 до 4 и их комбинация для диагностики и оценки степени бактериального вагиноза по оценке трех бактериальных морфотипов влагалища:

• А — Лактобациллы — большие грам-позитивные палочки (Lactobacillus acidophilus);
• B — Вагинальная гарднерелла и бактероиды — мелкие грамвариабельные и грамотрицательные кокки (Gardnerella vaginalis and Bacteroides species);
• C — Мобилункус — изогнутые грамвариабельные палочки (Mobiluncus species).

Мазок из влагалища окрашивают по Граму
и считают отдельно количество выявленных элементов флоры:

Баллы	A Lactobacilli	B Gardnerella	C Mobiluncus
	более 30 морфотипов	нет морфотипов	нет морфотипов
1	5 — 30 морфотипов	один морфотип	один морфотип
2	1-4 морфотипа	1-4 морфотипа	1-4 морфотипа
3	один морфотип	5 — 30 морфотипов	5 — 30 морфотипов
4	нет морфотипов	более 30 морфотипов	более 30 морфотипов

Количество полученных баллов суммируют (A+B+C). Интерпретация результатов по шкале Ньюджента:

7-10 баллов — бактериальный вагиноз;
4-6 баллов — промежуточный тип;
0-3 баллов — отсутствие бактериального вагиноза.

Показания к назначению исследований:

Обязательной процедурой при посещении гинеколога является взятие биологического материала для оценки состояния микрофлоры и клеток эпителия влагалища, внутренней слизистой оболочки тела матки, эндометрия, цервикального канала.

Гинекологический мазок, исследование и расшифровка которого проводится в лабораторных условиях, обладает высокой информативностью.

Анализ позволяет определить гормональный уровень репродуктивной системы, количество и состав влагалищных выделений, бактериальное содержание микрофлоры у женщин, предупредить воспалительные процессы, выявить патологии развития, наличие новообразований и инфекции, которые передаются половым путем.

Какие мазки можно сдавать

Заболеваниями женской половой системы занимается специализированное направление в медицине — гинекология.

Причин для обращения пациенток достаточно много: прохождение медкомиссии для приема на работу, беременность, болевые или неприятные схваткообразные ощущения в области нижней части живота, зуд или жжение, молочница, обильные менструации или выделения неизвестного происхождения.

Общий мазок или микроскопия проводится во время профилактического осмотра или в период планирования беременности. Результатом является изучение цервикального и мочеиспускательного канала, влагалища, у девственниц — прямой кишки.

Анализ Папаниколау на цитологию дает возможность вовремя обнаружить вирус папилломы, предраковые состояния эпителия, шейки матки. Рекомендуется проходить ПАП-тест всем представительницам женского пола, имеющим наследственные онкологические заболевания, лицам старше 21 года.

Бактериологический метод исследования, бакпосев у женщин, рекомендуется при подозрении на течение воспалительного процесса, нарушение микрофлоры, которое было вызвано условно-патогенными и патогенными микроорганизмами.

ПЦР проводится в виде анализа на инфекции, передающиеся, в основном, половым контактным путем. Дает полную информацию о бактериальном составе внутренней микрофлоры.

Эффективность и достоверность метода составляет 98%.

Подготовка к сдаче мазка

Прежде, чем назначать обследование, гинеколог или сотрудник лаборатории обязан предупредить пациентку о том, как правильно сдать мазок на флору, что можно и нельзя делать перед процедурой.

Подготовка к микроскопическому исследованию предусматривает отказ от сильнодействующих антибиотиков за 2 недели до предполагаемого анализа, посещения ванной комнаты накануне. Следует постараться не ходить в туалет за 2 часа до анализа.

Диагностику лучше делать не перед, а во время месячных и в первые два дня после.

Чтобы повысить чувствительность теста, бакпосев на микрофлору проводится при отсутствии лечения антибактериальными препаратами и спринцевания. Обязательно соблюдать специальный режим питания за 2-3 дня до бактериологического анализа: ограничить продукты, провоцирующие брожение или расстройство кишечника.

Воздержаться от полового сношения с партнером и не подмываться за 24 часа до забора данных.

За 3-5 дней перед назначенной ПЦР диагностикой запрещен прием любых антибактериальных и противозачаточных средств. За 36 часов необходимо исключить половые контакты. Желательно за сутки до ПЦР и накануне взятия анализа не ходить в душ. Материал берется во время менструации и на протяжении 1-2 дней после ее окончания.

Как берут мазок у женщин

Техника проведения забора материала проводится обычно в утренние часы в отделении гинекологии или непосредственно в самой лаборатории. Взятие влагалищных выделений и участков на исследование назначается только для женщин, которые живут половой жизнью. У девочек его берут более аккуратно с бокового свода влагалища, чтобы исключить повреждение девственной плевы, и из кишечника, выделения секрета.

Все манипуляции происходят на гинекологическом кресле. В это время специалист вводит специальное зеркало в зависимости от возраста и физиологических особенностей пациентки. Если органы еще не сформированы, используется размер XS, девушкам потребуется зеркало S. После родовой деятельность применяются инструменты для осмотра с диаметром 25-30 мм, размером M, L.

Сбор материала проводится шпателем или лопаточкой, щеточкой, наносится на предметное стекло или помещается в пробирку для дальнейшей передачи полученных результатов в лабораторию.

Мазок на микрофлору: расшифровка

Самостоятельно сделать вывод о том, насколько хороший или плохой мазок получился, невозможно без соответствующих знаний. С помощью специальных обозначений расшифровать микроскопическое исследование мазка очень просто. В зависимости от локализации взятого биологического материала различают: влагалище — «V», шейка матки — «C» и уретра — «U».

Грамположительные палочки, «Гр.+» и отсутствие кокковой флоры. Результат — «++++». Наблюдается достаточно редко, чаще всего является последствием интенсивной антибактериальной терапии. Норма: «++», «+++» палочки, количество кокков не превышает «++».

Грамотрицательные бактерии гонококки — «Gn», влагалищные трихомонады — «Trich», дрожжи рода «Candida». Соответствуют заболеваниям, как гонорея, трихомониаз и кандидоз.

Наличие ключевых клеток и кишечной палочки, если они указаны в составе микрофлоры, говорит о том, что у пациентки присутствует бактериальный вагиноз.

Мазок на флору: норма у женщин

Всем без исключения пациенткам, начиная с 14 лет и до наступления менопаузы, соответствует одна и та же норма, полученная в результате лабораторного микроскопического исследования.

Лейкоциты. Обеспечивая защиту организма от проникающих вирусов, бактерий и инфекций, могут быть в поле зрения, но не должны превышать показателя во влагалище — 10, в шейке матки — 30, уретре — 5.

Эпителий. Умеренное количество эпителиальной ткани — норма. Большое количество указывает на возможное воспаление, а слишком низкое — на недостаточную выработку гормона эстрогена.

Слизь. Допускается незначительное количество или ее отсутствие. Максимальная суточная норма выделений секрета желез канала шейки матки — 5 мл.

Грамположительные палочки, «Гр.+». Обязательно должны присутствовать лактобациллы и палочки Додерлейна в большом количестве. Они отвечают за иммунный ответ организма на чужеродные тела. В шейке матки и уретре их быть не должно.

«Гр.-», грамотрицательные, анаэробные палочки не определяются.

Гонококки с условным обозначением «gn», трихомонады, хламидии, ключевые и атипичные клетки, грибы, дрожжи, Candida отсутствуют. Если они обнаруживаются в результатах, пациентке назначается дополнительное обследование на гонорею, трихомониаз, хламидиоз, бактериальный вагиноз, молочницу.

Мазок на степень чистоты

Чтобы избежать осложнений в период вынашивания плода, беременным рекомендуется определять степень чистоты гинекологического мазка. В норме у здоровой женщины микрофлору влагалища на 95-98% составляют Bacillus vaginalis или лактобактерии палочки Додерлейна. Они вырабатывают молочную кислоту, которая способствует сохранению уровня кислотности.

Патогенные и условно-патогенные микроорганизмы не способны выживать в таких условиях. Но под действием различных факторов, как половая активность, менопауза, менструальный цикл и снижение иммунитета, показатели микрофлоры могут меняться.

• 1 степень чистоты влагалища в норме составляет рН 3,8-4,5. Среда — кислая. Лейкоциты и эпителиальные клетки — не более 10.
• 2 степень. Слабокислая среда: рН=4,5-5. Наблюдается незначительное увеличение грамположительных кокков, грибов Кандида.
• 3 степень. Активизируются патогенные микроорганизмы, появляется слизь, показатели эпителия превышают норму. Нейтральный уровень кислотности, рН=5-7. Лейкоцитов свыше 10. Слизь, ключевые клетки присутствуют, грамотрицательные и грамположительные микроорганизмы размножаются в благоприятных условиях микрофлоры.
• На последней, 4 степени, чистота низкая. Показатели рН достигают 7,5. Палочки Додерлейна или вообще отсутствуют, или находятся в единичном количестве. Влагалище заполнено болезнетворными микроорганизмами.

Бактериологическое исследование

Разнообразие состава, помимо лактобактерии палочки Додерлейна, который являются неотъемлемой частью микрофлоры влагалища обследуемой женщины, начинают изучать не сразу. Посев на специально созданную благоприятную среду собранного биологического материала для его последующего роста, развития и размножения занимает время.

Оценить бактериологический посев на флору можно через микроскоп при условии увеличения численности представителей микроорганизмов.

• 0 класс. Наблюдается при лечении антибиотиками. Возбудитель отсутствует.
• I класс. Количество бактерий не увеличивается или умеренный рост.
• II класс. Смешанный характер микрофлоры. Определяется до 10 колоний бактерий Gardnerella vaginalis или Mobiluncus, возбудителей гарднереллёза.
• III класс. Колоний насчитывается около 100. Преимущественно в микрофлоре обитают Gardnerella и Mobiluncus. Проявляются симптомы бактериального вагиноза.
• IV класс. Лактобактерии отсутствуют, иммунитет ослаблен. Диагноз приобретенного инфекционного заболевания — аэробного вагинит.

Цитологическое исследование

Вероятность обнаружить участки измененного эпителия, вируса папилломы и онкологических новообразований достаточно велика после 30 лет, начала половой жизни.

Поэтому гинекологи рекомендуют сдавать мазок на цитологию или ПАП-тест. Исходным материалом для цитологического исследования является: цервикальный канал, влагалищная часть шейки матки.

Правильная расшифровка ПАП-теста зависит от наличия или отсутствия раковых, нетипичных клеток.

• NILМ. Клиническая картина без особенностей, ЦБО. Лейкоциты и бактерии выделяются в небольшом количестве. Возможен первичный кандидоз или бактериальный вагиноз. Эпителиальный слой в норме.
• ASC-US. Обнаружены атипичные участки в эпителиальной ткани неизвестного происхождения. Повторный анализ проводится через 6 месяцев на поиск хламидиоза, дисплазии, вируса папилломы человека.
• LSIL. Для подтверждения предракового состояния, вызванного атипичными клетками, назначают биопсию, кольпоскопию. Слабо выраженные признаки изменения эпителия.
• ASC-H. Ярко выраженное поражение плоского эпителия. У 1% пациенток диагностируют начальную стадию рака шейки матки, остальные 98-99% имеют дисплазию 2-3 степени.
• HSIL. Сопутствующие симптомы, предшествующие раку плоского эпителия, шейки матки, выявлены у более чем у 7% обследуемых женщин. У 2% — рак.
• AGC. Атипичное состояние железистого эпителия. Диагноз: рак шейки матки или эндометрия, запущенная форма дисплазии.
• AIS. Плоскоклеточная карцинома, рак шейки матки.

ПЦР анализ

Высокой чувствительностью и достоверностью полученных данных отличается молекулярно-биологический метод ПЦР диагностики. Благодаря созданию более ранних образцов выделенного и скопированного участка ДНК происходит сравнение с полученным биологическим материалом.

Анализ на инфекции с помощью ПЦР дает возможность за короткий срок найти возбудителя заболевания женских половых органов с помощью получения положительного или отрицательного результата.

Полимеразная цепная реакция облегчает определение хламидиоза, уреаплазмоза, молочницы, трихомониаза, ВПЧ, ВИЧ, поиск причин течения тяжелой беременности и гормональных нарушений.

Недостатками ПЦР являются случаи ложных данных при неправильно проведенных тестах, возможной мутации ДНК возбудителя.