Medistok » Медицина » Микробиологическая диагностика менингококковой инфекции

Диагностика менингококковой инфекции основана на бактериоскопическом исследовании, выделении культуры и биохимической идентификации возбудителя. Материалы для исследования — СМЖ, кровь и отделяемое носоглотки.

В окрашенных мазках обнаруживают грамотрицательные диплококки или одиночные кокки, что значительно облегчает распознавание возбудителя при характерной клинической картине (рис. 16-6). Следует помнить, что в мазках СМЖ обнаружить менингококки довольно трудно; в этих случаях диагноз подтверждают обнаружением Аг N. meningitidis в реакциях латекс-агглютинации или встречного иммуноэлектрофореза. В период менингококкемии грамотрицательные диплококки могут быть обнаружены в окрашенных мазках из соскобов петехиальных высыпаний, а также в лейкоцитах периферической крови.

Диагностика менингококка. Выявление менингококка

Проводят посев материала на твёрдые или полужидкие питательные среды, содержащие сыворотку, кровь или асцитическую жидкость. Культуры инкубируют при 37 °С и повышенном содержанием (8-10%) С02. Оксидаза-положительные колонии предположительно рассматривают как принадлежащие к видам Neisseria. Менигококки образуют мелкие нежные полупрозрачные колонии диаметром 2-3 мм. Наличие в культуре N. meningitidis подтверждает ферментация глюкозы и мальтозы, но не лактозы, сахарозы и фруктозы. Принадлежность к серогруппам определяют серологически (РА). Выделение возбудителя не всегда удачно; в диагностике менингококковых инфекций большую роль играет обнаружение Аг N. meningitidis и AT к ним.

Аг менингококка распознают в реакции коагглютинации, латекс-агглютинации, встречного электрофореза и ИФА. AT распознают в РПГА и ИФА с использованием группоспецифичных полисахаридных диагностикумов.

Микроскопический метод. Мазки из осадка спинномозговой жидкости окрашивают по методу Грама и микроскопируют. При наличии гноя и обнаружении внутри лейкоцитов грамотрицательных диплокок­ков в виде «бобов» или «кофейных зерен», обращенных вогнутой

стороной друг к другу, позволяет сделать положительное заключение о наличии у пациента менингококковой инфекции (рис. 22).

А б

Рис. 22. Менингококк(Neisseria meningitides) в спинно-мозговой жидкости больного эпидемическим цереброспинальным менингитом (а) и в чистой культуре (б). Окраска по Граму. х630

Микроскопическое исследование мазков из носоглотки бактерионосителей дает возможность выявить наряду с менингококком стафилококки, стрептококки и непатогенные нейссерии (Moraxella spp. и др.), дифференциро­вать которые по морфологическим и тинкториальным свойствам практически невозможно.

Бактериологический метод.Исследуемый материал засевают петлей на чашки с сывороточным МПА, содержащим антибиотики (ристомицин, ванкомицин, колистин и ниста-

тин) для подавления роста сопутствующей микрофлоры (преимущественно кокков). Асцитическая жидкость в качестве добавки к питательным средам в настоящее время не

применяется, так как в результате лечения больных в ней накапливаются вещества, ингибирующие рост микроорганизмов (в том числе менингококка). Ме­нингококк на сывороточном МПА вырастает при температуре 37 0 С в атмосфере с повышенным содержанием СО2 (используют СО2 инкубатор, газогенераторные пакеты или эксикатор с зажженной свечой) через 48 часов, колонии величиной с булавочную головку, прозрачные, с голубоватым оттенком и ровными краями. В мазках из чистой культуры менингококка (рис.21) микрокартина иная (полиморфные дипло- и тетракокки), чем в мазках из спинно-мозговой жидкости.

Типичные для менингококка колонии пере­севают в пробирку со скошенным сывороточным МПА для выделения чистой культуры. Идентификацию чистой культуры менингококка, ее дифференциацию от сап­рофитных нейссерий, обитающих в носоглотке, проводят на основании изучения комплекса биологических свойств (табл. 18).

Таблица 18.Основные биологические свойства нейссерий

Свойства Виды нейссерий
N.meningitidis N.subflava N.flava N.mucosa N.sicca
Рост на МПА + + + +
Потребность в СО2 +
Желтый пигмент + + ± ±
Ферментация: глюкозы мальтозы сахарозы фруктозы лактозы К+ К+ — — — К+ К+ К± К± — — — — — — К+ К+ К+ К+ — К+ К+ К+ К+ —
Образование полисахарида из сахарозы ± + + +
Нитратредуктаза +
РА с менингококковыми сыворотками сероваров А., В, С +

Обозначения: (+) – наличие признака, (-) – отсутствие признака, (±) – непостоянный признак, К – образование кислоты

Специфичес­кий полисахаридный менингококковый антиген можно выявить в спинномозговой жидкости с помощью метода встречного иммуноэлектрофореза в геле. С этой целью в агаровом геле на стеклянных пластин­ках, размером 9×12 см, вырезают два параллельных ряда лунок диаметром 3 мм. В лунки одного ряда вносят исследуемый ликвор, в лунки другого — преципитирующие сыворотки против менингококков разных серогрупп. Пластинки помещают в аппарат для иммуноэлектрофореза на 40-45 мин при комнатной температуре. Положительный результат характеризуется появлением 1-2 полосок преципитации между лунками со спинномозговой жидкостью и соответствующей антисывороткой.

Генодиагностика. Исследуемый материал используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР, что дает основание в случае получения положительного результата поставить предварительный диагноз.

Серодиагностика.Для ретроспективного подтверждения диа­гноза используют РНГА с парными сыворотками.

Экспресс-методы диагностики.Для выявления антигенов менингококков в мазках из исследуемого материала использу­ют ИФМ, а также непрямую латекс-агглютина­цию и РНГА с антительными диагностикумами.

Самостоятельная работа студентов

1. Микроскопический метод. Изучение морфологии менинго­кокка в мазках из ликвора больного с подозрением на менингококковую инфекцию (демонстрация). Типично наличие грамотрицательных диплококков, располагающихся внутри лейко­цитов.

2. Бактериологический метод. Учет культуральных свойств менингококка на сывороточном МПА с ристомицином. Колонии ме­нингококков прозрачные с голубым оттенком, ровные, мелкие (с булавочную головку). Изучить биохимические свойства менингококка в соответствии с таблицей .

Читайте также:  Эффективное лечение трихомониаза у женщин

3. Учесть демонстрационную РНГАс парными сыворотками больного (7 и 14 дни болезни) с подозрением на менингококковую инфекцию.

4. Биопрепараты для диагностики и профилактики менингококковой инфекции:

· отечественная химическая вакцина полисахаридная менингококковая вакцина групп А и С. Применяется по эпидемиологическим показаниям. В России зарегистрирована также кубинская В+С менингококковая вакцина, состоящая из белков менингококков группы В и полисахаридов менингококка группы С, а также полисахаридная вакцина МенингоА+С фирмы Пастер Мерье Коннот;

· агглютинирующие и преципитирующие сыворотки против менингококка, применяются с диагностической целью для постановки РА с целью серологического типирования менингококка и встречного иммуноэлектрофореза для обнаружения менингококкового антигена в спинно-мозговой жидкости.

· эритроцитарные антительные менингококковые диагностикумы для обнаружения антигенов менингококка в спинномозговой жидкости с помощью РНГА.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: При сдаче лабораторной работы, студент делает вид, что все знает; преподаватель делает вид, что верит ему. 9530 — | 7348 — или читать все.

91.146.8.87 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.

Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)

очень нужно

к приказу Минздрава СССР

от 1 декабря 1986 г. N 858

Методические указания
по микробиологической диагностике менингококковой инфекции и бактериальных менингитов

1. Показания к лабораторному исследованию

Лабораторная диагностика менингококковой инфекции и ГМ осуществляется бактериологическим методом путем выделения и идентификации возбудителя, серологическим — путем выявления специфических антигенов в жидкостях организма (ликвор, кровь, синусоидальная жидкость и др.) или антител в сыворотке крови *(1). Лабораторное обследование проводят с диагностической целью и по эпидемиологическим показаниям. С диагностической целью обследуют больных с клинически выраженной формой заболевания, стертой формой (назофарингит) и с подозрением на менингококковую инфекцию и менингиты иной этиологии.

По эпидемиологическим показаниям обследуют лиц, бывших в контакте с больными менингококковой инфекцией.

2. Микробиологическая диагностика менингококковой инфекции и других гнойных бактериальных менингитов

В связи с тем, что наряду с менингококками, наиболее частыми этиологическими факторами ГМ могут быть пневмококки, а у детей младшего возраста Н. influenzae и др. возбудители, представляется целесообразным изложение основных дифференциально-диагностических признаков и методов выделения этих микроорганизмов. По классификационной систематике бактерий Bergey (1 том, 1984), менингококи # принадлежат к семейству Neisseriaceae роду Neisseria. Род нейссерий включает два вида патогенных микроорганизмов: N. meningitidis и N. gonorrhoeae, остальные представители этого рода являются резидентной флорой слизистых оболочек. К последним относятся пигментообразующие, объединенные в один вид N. subflava, а также N. sicca, N. mucosa, N. flavescens, N. lactamica. Катаральный диплококк выделен в род Moraxella и обозначен как Moraxella (Branhainella) catarrhalis.

Менингококки требовательны к условиям культивирования. При росте требуют повышенной влажности и 5-10% содержания CO2 в воздухе, чувствительны к малейшим отклонениям температуры. В качестве источника пативного белка рекомендуется применять сыворотку крупного рогатого скота, лошадиную или кровь любого другого животного. Основой для приготовления сред могут служить бульоны на основе гидролизата мяса по Хоттингеру, "эритрит-агар", агар АГВ, сухой питательный агар специального назначения, выпускаемый Дагестанским институтом питательных сред или "Аминопептид для микробиологических питательных сред" (жидкий, производства Ставропольского мясоконсервного комбината, ТУ-92-14/356-80).

Идентификация вида N. meningitidis основана на комплексе морфологических, тинкториальных, культурных и биохимических признаков (табл. 1). При первом выделении клеткам менингококков свойственен полиморфизм, который проявляется в различной величине и разной интенсивности окрашивания микробных клеток. Колонии менингококков имеют маслянистую консистенцию, легко снимаются петлей со среды, что отличает их от колоний непатогенных нейссерий, имеющих крошащуюся или тянущуюся консистенцию. Некоторые штаммы, выделенные из СМЖ, могут обладать слабой ферментативной активностью в отношении глюкозы или мальтозы или обоих углеводов. Большинство непатогенных видов нейссерий, в отличие от патогенных, способны при выращивании на сывороточном агаре с 5% сахарозы образовывать крахмалоподобное вещество (полисахарид), выявляемое с помощью водного раствора Люголя, в виде появления бурого окрашивания культуры.

Менингококки делятся на следующие серогруппы: А, В, С, X, Y, Z, 29Е и 135W. Проведение серологического группирования менингококков является обязательным для практических лабораторий, как одна из мер эпидемиологического надзора за менингококковой инфекцией.

Наличие ферментов оксидазы и каталазы присуще всем нейссериям и М. catarrhalis в отличие от гемофилов и пневмококков, что может служить дифференцирующим признаком при их идентификации в сочетании с другими (табл. 2).

Пневмококки и гемофилы, как и менингококки, являются высокотребовательными к культивированию микроорганизмами. В качестве фактора, способствующего их росту используют кровь различного происхождения. Поэтому универсальной средой для всех возбудителей может служить "шоколадный" агар.

Культуральные и биохимические свойства нейссерий и М. catarrhalis

К — образование кислоты; (-) — редко;

** — тест используют как дополнительный при дифференциации непатогенных нейссерий

Читайте также:  Лечение травами жкт

Примечание: приготовление питательных сред, дифференциально-диагностических (среды с углеводами), приготовление реактивов для исследования редукции нитратов и нитритов, постановка этих реакций и учет. См. приказ МЗ СССР N 535 от 22 апреля 1985 г. "Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования".

Свойства основных возбудителей менингитов, учитываемые через 24 часа от начала бактериологического исследования

* В каплю 3% раствора КОН вносят петлю (колонию) культуры, эмульгируют. Образование в капле студенистой массы, тянущейся за петлей указывает на наличие грамотрицательной флоры (-), крошащуюся консистенцию образует грамположительная флора (+).

** Постановка реакции на оксидазу, каталазу, уреазу см, приказ МЗ СССР N 535.

3. Бактериологическое исследование спинномозговой жидкости больного

3.1. 1-й день исследования. Спинномозговую жидкость (СМЖ) в количестве 2-5 мл берут у больного сразу же при поступлении в стационар с соблюдением всех правил асептики. Взятие ликвора проводится персоналом в масках.

Первую порцию СМЖ (около 1 мл) берут в отдельную пробирку для проведения общего ликворологического исследования. Вторую порцию, предназначенную для бактериологического исследования, наливают в стерильную центрифужную или агглютинационную пробирку. Касаться руками краев канюли и краев пробирки нельзя. Ватную пробку полагается держать на весу за ее наружную часть. Если немедленно доставить жидкость в лабораторию невозможно, допустимо хранение в течение нескольких часов в термостате при температуре 37° или в термосе. Во время транспортировки СМЖ следует тщательно предохранять от охлаждения (например, доставлять в термосе). СМЖ исследуют немедленно при доставке в лабораторию. Стерильной пастеровской пипеткой со дна пробирки берут 0,3-0,5 мл материала и по 2-3 капли засевают на поверхность 2 чашек Петри с подогретой питательной средой, растирая шпателем. Одна чашка содержит "шоколадный" агар, вторая — сывороточный. Посевы ставят в термостат при 37° и создают условия повышенного содержания CO2 в воздухе.

Спинномозговую жидкость, оставшуюся в пробирке, используют для посева на среду "обогащения" (полужидкий агар) и одновременно в реакции встречного иммуноэлектрофореза *(2.) (п.11.3).

Оставшийся в пипетке материал используют для приготовления мазков. Отношение к окраске по Граму у нейссерий выражено недостаточно четко, поэтому они окрашиваются метиленовой синью или по Граму в модификации Калины. Прямая микроскопия окрашенных мазков спинномозговой жидкости в известной части случаев позволяет установить наличие бактерий, вызывающих гнойный менингит. Морфология менингокков описана выше. Н. influenzae видна в виде мелких полиморфных грамотрицательных палочек и нитей, окруженных еле заметной нежной капсулой. Пневмококки имеют вид ланцетовидных диплококков и коротких цепочек, образуют капсулу. Они грамположительны, хорошо красятся всеми анилиновыми красками, при этом капсула остается неокрашенной и заметна только на окрашенном фоне *(3). Результаты бактериоскопии немедленно сообщают лечащему врачу в виде предварительного ответа. При достаточном количестве исследуемого материала рекомендуется 2-3 капли засеять на чашку с питательной средой для определения чувствительности к антибиотикам.

3.2. 2-й день исследования. Независимо от результатов бактериоскопии ликвора просматривают засеянные чашки. Просмотр чашек ведут визуально и с помощью бинокулярного стереоскопического микроскопа, лупы МБС. Во внимание принимают все колонии. Чашки с отсутствием роста инкубируют дополнительно одни сутки. Готовят препараты-мазки, окрашивают, ставят реакцию с 3% раствором КОН и биохимические тесты — на оксидазу, каталазу, уреазу. Гемофилам присущ резкий специфический запах, исходящий от посевов.

Морфология менингококковых колоний на сывороточном агаре описана во всех руководствах по микробиологии. На "шоколадном" агаре колонии нежные, сероватого цвета, с блестящей поверхностью и ровными краями, имеют маслянистую консистенцию, размерами от 0,1 до 3,0 мм. Менингококки не меняют цвета среды. На основании микроскопии мазков из колоний и результатов первичных биологических тестов возможна выдача предварительного ответа. Если в мазках обнаружены грамотрицательные кокки, это дает право отнести их к роду нейссерий и провести дифференциацию видов.

Гемофилы на "шоколадном" агаре дают довольно обильный рост. Колонии серого цвета, плоские диаметром 0,2-2,0 мм, легко снимаются со среды. В мазках, окрашенных по Граму, видны мелкие короткие грамотрицательные палочки с капсулой разной степени выраженности, а также нити разной длины, и короткие цепочки. На сывороточном агаре Н. influenzae не растет *(4). Крупные (3-5 мм) колонии, содержащие грамотрицательные палочки, подозрительны на энтеробактерии. Candida и P. aeruginosa растут обильно на всех средах, не изменяя цвета "шоколадного" агара.

Колонии пневмококков на обеих средах — мелкие (диаметром 0,1-1,0 мм),иногда плоские, с вдавлением в центре. На "шоколадном" агаре они окружены зоной желто-зеленого гемолиза (тип альфагемолиза). По внешнему виду колонии пневмококков на обеих средах трудно отличить от колоний стрептококков группы В, зеленящих стрептококков, энтерококков (S. feacalis), которые в редких случаях могут вызвать менингит, особенно у детей 1 года. В мазках из колоний пневмококки имеют овальную или шаровидную форму, располагаются парами или в виде коротких цепочек из 2-3 пар.

Если имеется обильный рост одинаковых колоний, то допустим одномоментный отсев на дифференциально-диагностические среды, изучение культуры по ряду признаков и антибиотикочувствительность (табл. 1, 2). Определение чувствительности энтеробактерии и стафилококков проводят на среде АГВ. Эта среда служит основой для определения чувствительности к антибиотикам менингококков, при добавлении 20% сыворотки, Н. influenzae и пневмококков — при добавлении соответствующего количества крови. Приготовление питательных сред и постановка теста на антибиотикочувствительность производится в соответствии с действующими указаниями *(5).

Читайте также:  Моча изменила запах причины

В таблице 2 суммировано минимальное число признаков, достаточное для того, чтобы выделенные из СМЖ бактерии предположительно отнести к тому или иному таксону (от семейства до вида) и избрать дальнейший путь идентификации. На этом этапе возможна выдача предварительного (а для Н. influenzae окончательного) ответа.

Колонии, подозрительные на менингококки, отсевают на скошенный сывороточный агар или сектор этой среды в чашке на бессывороточный агар и помещают в термостат при 37°. Колонии, подозрительные на пневмококки и др. стрептококки, отсевают на 2 сектора кровяного агара (с 5% крови) для последующего определения чувствительности к желчи и постановки тестов на лекарственную чувствительность.

Если число выросших колоний мало (1-2), то их отсевают на чашку с сывороточным или "шоколадным" агаром для накопления микробной массы, а идентификацию микроба проводят еще через одни сутки.

При менингитах новорожденных и детей раннего возраста, а также изредка и в других возрастных группах, помимо трех перечисленных видов микроорганизмов этиологическими факторами могут быть энтеробактерии (Е. cjli, S. marcesctns, К. pneumonift, Salmonella, Citrobacter, Enterobacter), синегнойная палочка (P. aeruginosa, Acinetobacter calcoaceticum, Listeria monocytogenes, различные стрептококки гемолитические группы В, "зеленящие" и энтерококки, а также стафилококки (золотистый и эпидермальный) и грибы рода Candida.

При подозрении на энтеробактерии *(6), синегнойную палочку *(7), стафилококк *(8) и Ac. calcoaceticum проводят исследования в соответствии с имеющимися методическими материалами +.

При подозрении на листерии в этот день, если число колоний позволяет, ставят ряд проб, а также тест на чувствительность к антибиотикам. Для L. monocytogenes помимо признаков, указанных в табл. 2, характерно: подвижность при комнатной температуре, разложение мальтозы, глюкозы, инактивность по отношению к дульциту, манниту, сорбиту и арабинозе. Сахароза и глицерин разлагаются медленно. L. monocytogenes образуют краевую зону гемолиза на arape с 5% бараньей крови, разлитом слоем 3 мм.

Для идентификации Candida albicans делают посев из подозрительных белых выпуклых колоний, состоящих из дрожжевых клеток, на среду Сабуро или мясо-пептонный агар, содержащий по 100 ME/мл пенициллина и стрептомицина.

Если прямой посев на чашки с питательной средой не дал роста колоний, то делается высев на чашки с сывороточным "шоколадным" агаром из инкубированной в термостате смеси ликвора с полужидким агаром (среда "обогащения").

При отрицательных результатах высев со среды "обогащения" повторяют через 1-2 дня в течение 7 дней инкубации в термостате.

При получении роста колоний исследование их проводят тем же путем, что и при прямом посеве спинномозговой жидкости.

3.3. 3-й день исследования. Культуры, отсеянные из отдельных колоний, просматривают под МБС и ставят пробу с 3% раствором КОН. Для оценки чистоты выросшей культуры готовят мазки и просматривают. При обнаружении морфологически типичных грамотрицательных кокков, проводят идентификацию (см. табл. 1), серогруппирование идентифицированной культуры (п. 11), а также используют эту культуру для определения лекарственной устойчивости (если эти тесты не были сделаны на 2-й день).

Учитывают результаты посевов, сделанных на 2-й день исследования. На этом этапе возможна выдача окончательного положительного ответа для менингококков и др. микроорганизмов (кроме пневмококков и стрептококков).

Для дифференциации пневмококков, зеленящих и фекальных стрептококков (энтерококков) после микроскопии чистых культур на секторах кровяного агара учитывают характер гемолиза вокруг выросших колоний и ставят дополнительно пробы *(9) (см. табл. 3).

На одних из двух секторов кровяного агара с ростом колоний накладывают диск из фильтровальной бумаги, пропитанной 20% раствором желчи (на физиологическом растворе), после чего чашку помещают при 37° на 1-2 часа. По истечении этого времени вокруг диска колонии пневмококков лизируются, образуя зону отсутствия роста шириной 1-2 мм, в то время как рост прочих стрептококков остается интактным. При положительной пробе чувствительности к желчи, при условии типичной морфологии клеток и колоний, можно дать положительный ответ о выделении пневмококков. Рост культуры на 2-м секторе кровяного агара используют для постановки пробы на чувствительность к лекарственным препаратам (если это не было сделано ранее).

При отрицательных результатах пробы на чувствительность к желчи, рост на 2-м секторе используют не только для испытания чувствительности к химиопрепаратам, но и для постановки ряда тестов, дифференциирующих # стрептококки (см. табл. 3).

Дифференцирующие свойства стрептококков, вызывающих менингит

Виды
Свойства
S,
pneumoniae
S. faecalis
(гр. Д)
S. agalactiae
(гр. В)
«Зеленя-
щие"*
Гемолиз на 5% кровяном
агаре

Лизис на кровяном агаре
вокруг диска с 20% жел-
чью

Рост после прогрева при
60° С, 30 мин.

Обратите внимание

Эссенциале состав препарата

Содержание1 Препарат «Эссенциале форте»: состав и форма выпуска2 Фармакологически свойства «Эссенциале»3 Показания к применению4 Как ...

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Adblock detector