Medistok » Медицина » Полимеразная цепная реакция пцр используется для

Сайт предоставляет справочную информацию исключительно для ознакомления. Диагностику и лечение заболеваний нужно проходить под наблюдением специалиста. У всех препаратов имеются противопоказания. Консультация специалиста обязательна!

Метод полимеразной цепной реакции был открыт почти тридцать лет назад американским учёным по имени Кэрри Мюллис. Методика широко распространена в медицине в качестве диагностического инструмента, и суть её состоит в копировании участка ДНК при помощи специального фермента (полимеразы) искусственным путём в пробирке.

В каких областях медицины применяется этот метод?

Для чего выполняется копирование ДНК и как это может послужить медицине?
Данная методика позволяет:

  • Выделять и клонировать гены.
  • Диагностировать генетические и инфекционные заболевания.
  • Определять отцовство. Ребенок частично наследует от своих биологических родителей генетические особенности, однако имеет при этом свою собственную уникальную генетическую идентификацию. Наличие у него некоторых генов, идентичных родительским генам – позволяет говорить об установлении родства.

Полимеразная цепная реакция применяется также в криминалистической практике.

На месте преступления судмедэксперты собирают образцы генетических материалов. К ним относятся: волосы, слюна, кровь. Впоследствии, благодаря методике полимеразной реакции, можно амплифицировать ДНК и сравнить идентичность взятой пробы с генетическим материалом подозреваемого человека.

В медицине эффективно используется полимеразная цепная реакция:

  • В пульмонологической практике – для дифференциации бактериальных и вирусных видов пневмонии, туберкулёза.
  • В гинекологической и урологической практике – для определения уреаплазмоза, хламидиоза, микоплазменной инфекции, гарднереллеза, герпеса, гонореи.
  • В гастроэнтерологической практике.
  • В гематологии – для определения онковирусов и цитомегаловирусной инфекции.
  • В экспресс-диагностике таких инфекционных заболеваний как вирусные гепатиты, дифтерия, сальмонеллёз.

В настоящее время наиболее распространен данный метод в диагностике инфекционных болезней (гепатитов вирусной этиологии, ВИЧ, венерических заболеваний, туберкулёза, клещевого энцефалита).

Что происходит во время протекания реакции?

Сама реакция является химически несложной. Источником ДНК для реакции может послужить капля крови, волос, кусочек кожи, и т.д. В теории, для проведения реакции требуются нужные реагенты, пробирка, проба из биологического материала и источник тепла.

Полимеразная реакция позволяет выявить инфекцию, даже если в пробе с биологическим материалом находится всего одна или несколько ДНК-молекул возбудителя.

Во время протекания реакции, благодаря ферменту ДНК-полимеразы, происходит удвоение (репликация) участка ДНК. Сама же дезоксирибонуклеиновая кислота (сокращенно ДНК) важна для нас тем, что обеспечивает хранение и передачу дочерним клеткам генетической информации. ДНК имеет вид спирали, которая состоит из повторяющихся блоков. Эти блоки составляют нуклеотиды, которые являются наименьшей частицей ДНК. Нуклеотиды образуются из аминокислот.

Процесс репликации участков ДНК происходит во время повторяющихся циклов. В каждый такой цикл копируется и удваивается не только исходный фрагмент ДНК, но и те фрагменты, которые уже удвоились в прошлый цикл амплификации. Все это напоминает процесс геометрической прогрессии.

Существует:

  • Естественная амплификация (то есть процесс копирования и размножения ДНК), которая происходит в нашем организме и является детерминированным, предопределённым процессом.
  • Искусственная амплификация, которая происходит благодаря полимеразной цепной реакции. В этом случае процесс копирования является управляемым и позволяет удвоить даже короткие участки нуклеиновой кислоты.

После завершения каждого цикла копирования, количество фрагментов нуклеиновой кислоты возрастает в геометрической прогрессии. Именно поэтому сам процесс называют «цепной реакцией».

Спустя тридцать — сорок циклов число фрагментов достигает нескольких миллиардов.

Для амплификации in vitro (в пробирке) необходимо, чтобы в биосреде, взятой для диагностики, присутствовал специфический чужеродный фрагмент ДНК (то есть ДНК не пациента, а возбудителя). Если в созданном растворе не будет находиться специфический фрагмент – цепная реакция под действием полимеразы не пойдет. Этим и объясняется факт высокой специфичности ПЦР.

Этапы ПЦР-диагностики

6. Путём проведения электрофореза подводится итог, и подсчитываются результаты удвоения.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – метод высокой точности в области диагностирования наследственных патологий, инфекций, вирусных болезней в любой стадии (острой или хронической), а также — на раннем этапе — до очевидных проявлений болезни путем идентификации возбудителей, на основе их ДНК, РНК, являющихся генетическим материалом, в пробах, которые получают от пациента. И сегодня мы поговорим про суть, этапы диагностики и принципы методов полимеразной цепной реакции (ПЦР), а также о ее стоимости.

Что такое полимеразная цепная реакция

Основа анализа — амплификация (удвоение) – создание множества копий из короткого участка ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты), представляющей генетический комплекс человека. Для исследования нужно очень малое количество физиологического вещества (мокрота, каловые массы, соскоб эпителия, сок простаты, кровь, сперма, околоплодные воды, слизь, ткань плаценты, моча, слюна, жидкость плевральная, цереброспинальная). При этом, например, в мочеполовом тракте больного возможно обнаружение даже единичного вредоносного микроба.

  • в раннем диагностировании инфекций, генетических, онкологических патологий;
  • в судебно-медицинской экспертизе при наличии для исследования крайне малого количества ДНК;
  • в ветеринарной медицине, фармацевтике, биологии, молекулярной генетике;
  • для идентификации личности по ДНК, подтверждения отцовства;
  • в палеонтологии, антропологии, экологии (при отслеживании качества продуктов, факторов внешней среды).

О том, что такое полимеразная цепная реакция, расскажет в подробностях данное видео:

Кому ее назначают

Полимеразная цепная реакция в диагностике инфекционных заболеваний — одна из наиболее надежных методик особой точности и достоверности. К примеру, достоверность проведенного анализа ПЦР на хламидии и на многие другие патогены приближается к 100% (абсолютная). Чаще всего процедуру полимеразной цепной реакции назначают пациентам, у которых при диагностировании возникают сложности с идентификацией конкретного возбудителя.

Читайте также:  Удаление кондилом радиоволновым методом цена в москве

Лабораторный тест ПЦР применяют:

  • для обнаружения болезнетворных организмов, вызывающих инфицирование мочевыводящих и половых органов, трудно идентифицируемых при использовании посевов или методов иммунологии;
  • для повторного диагностирования ВИЧ на начальной стадии в случае положительного, но вызывающего сомнения результата первичного анализа (например, у новорожденных от инфицированных СПИДом родителей);
  • для установления онкологического заболевания на раннем этапе (изучение мутаций онкогенов) и индивидуальной коррекции схемы лечения у конкретного пациента;
  • с целью раннего выявления и потенциального лечения наследственных патологий.

Так, будущие родители сдают анализ, чтобы узнать, являются ли они носителями генетической патологии, у детей ПЦР определяет вероятность подверженности болезни, передающейся по наследству.

  • для обнаружения патологий плода на раннем сроке вынашивания (отдельные клетки растущего эмбриона исследуют на наличие возможных мутаций);
  • у пациентов перед трансплантацией органов – для «тканевого типирования» (определения совместимости тканей);
  • для выявления опасных патогенных организмов в донорской крови;
  • у новорожденных малышей – для выявления скрытых инфекций;
  • для оценки результатов антивирусного и антимикробного лечения.

Зачем проходить такую процедуру

Поскольку ПЦР — высокоэффективный способ диагностики, дающий почти 100% результат, процедуру используют:

  • для подтверждения или исключения окончательного диагноза;
  • быстрой оценки эффективности проводимой терапии.

Во многих случаях ПЦР — единственно возможный тест для обнаружения развивающегося заболевания, если прочие бактериологические, иммунологические и вирусологические методики диагностирования оказываются бесполезными.

  • Вирусы обнаруживаются с помощью процедуры ПЦР сразу после инфицирования и до появления признаков болезни. Раннее выявление вируса позволяет оперативно назначить лечение.
  • Так называемая «вирусная нагрузка» (или — количество вирусов в организме) также определяется при анализе ДНК количественным методом.
  • Конкретные болезнетворные организмы (например, туберкулезную палочку Коха) сложно и слишком долго культивировать. Анализ ПЦР позволяет быстро выявить минимальное количество патогенов (живых и мертвых) в образцах, удобных для исследования.

Подробный анализ ДНК патогена используется:

  • чтобы определить его чувствительность к конкретным видам антибиотиков, что позволяет немедленно приступить к лечению;
  • чтобы контролировать распространение эпидемий среди домашних, диких животных;
  • чтобы выявить и отслеживать новые заразные виды микробов и подтипы патогенов, которые спровоцировали предыдущие эпидемии.

Виды диагностики

Стандартный метод

Анализ полимеразно-цепной реакции проводится на основе многократной амплификации (удвоения) конкретного фрагмента ДНК и РНК при использовании особых ферментов-праймеров. В результате цепочки копирования получается количество материала, достаточное для исследования.

В ходе процедуры копируется только искомый фрагмент (соответствующий заданным конкретным условиям) и в случае, если он действительно присутствует в пробе.

О том, как проходит ПЦР, рассказывает это подробное видео с полезными схемами:

Другие методы

  • ПЦР , проводимая в режиме реального времени. В этом виде исследования процесс выявления заданного фрагмента ДНК запускается после прохождения каждого цикла, а не после осуществления всей цепочки 30 – 40 циклов. Этот вид исследования позволяет получить информацию о количестве патогена (вируса или микроба) в организме, то есть осуществлять количественный анализ.
  • ОТ-ПЦР (режим обратной транскрипции). Этот анализ используют, чтобы найти РНК с одной цепочкой для обнаружения вирусов, генетической базой которых является именно РНК (например, вирус гепатита С, иммунодефицита). При таком исследовании используется особый фермент — обратная транскриптаза и определенный праймер и на базе РНК строится одноцепочная ДНК. Затем из этой цепочки восстанавливают вторую цепь ДНК и выполняется стандартная процедура.

Показания для проведения

Процедура ПЦР применяется в клинике инфекционных болезней, неонатологии, акушерстве, педиатрии, урологии, гинекологии, венерологии, неврологии, нефрологии, офтальмологии.

Показания для назначения анализа:

  • выяснение риска развития генетических отклонений у ребенка при вероятности наследственных патологий;
  • диагностирование обоих родителей при планировании беременности или тяжелом состоянии матери при протекающей беременности;
  • трудности с зачатием, выявление причин бесплодия;
  • подозрение на половые инфекции в острой стадии и при симптоматике перехода их в хроническую;
  • обнаружение причин воспалительных процессов неясного происхождения;
  • незащищенные случайные и постоянные половые контакты;
  • определение чувствительности патогенного микроорганизма к конкретным антибиотикам;
  • пациентам с подозрением на скрытую инфекцию для обнаружения патогенов до развития явной симптоматики (доклиническое диагностирование);
  • больным для подтверждения выздоровления после болезни (ретроспективная диагностика);:

Также используется диагностика при необходимости точного выявления следующих возбудителей::

  • вирусы гепатита (A B C G), иммунодефицита человека, цитомегаловирус;
  • вибрион холерный;
  • вирус простого герпеса, герпетиформные виды;
  • ретро – адено – и риновирусы;
  • вирусы краснухи, Эпштейна-Барр, варицелла (Зостер – вирус);
  • парво – и пикорновирусы;
  • вирус папилломы;
  • онкогенные вирусы;
  • бактерия Helicobacter pylori;
  • легионеллы, патогенные типы палочки кишечной;
  • стафилококк золотистый;
  • возбудитель менингита;
  • клостридии, дифтерийная и гемофильная палочка;

Используется и для определения инфекций:

  • инфекционный мононуклеоз;
  • боррелиоз, листериоз, клещевой энцефалит;
  • кандидоз, вызываемый грибками Cand >Противопоказания для проведения

Поскольку процедура проводится не с пациентом, без какого-либо воздействия на организм, а с биологическим материалом, взятым для исследования, то никаких противопоказаний для ПЦР не имеется по причине отсутствия потенциальной опасности.

Однако забор биоматериала из шеечного канала матки не проводят после процедуры кольпоскопии. Сдача мазков, соскобов на анализ разрешена только через 4 – 6 дней после окончания менструации и полного прекращения выделений.

Безопасен ли метод

Никакое негативное влияние на пациента при изолированном исследовании его биоматериала в лабораторных условиях невозможно.

Подготовка к процедуре (сдача биологических веществ на анализ)

В качестве образца для анализа ПЦР, при котором выявляют ДНК чужеродного патогена, служит любая биологическая жидкость, ткань, выделения организма. Забор исследуемого вещества проводят в виде взятия крови из вены, соскоба из гортани, полости носа, мочеиспускательного канала, плевральной полости, шейки матки.

Перед диагностической процедурой врач объясняет пациенту, забор какого материала будет взят:

  1. При обследовании на половые инфекции, производится забор выделений из половых органов, моча, мазок из уретры.
  2. При анализе на герпетические инфекции, цитомегаловирус, мононуклеоз – берут на анализ мочу, мазок из зева, на гепатит, токсоплазмоз — кровь из вены.
  3. С целью диагностирования различных видов поражений нервной системы проводится забор спинномозговой жидкости.
  4. В пульмонологии образцы для анализа — мокрота и жидкость плевральная.
  5. Когда проводят исследование возможных внутриутробных инфекций при вынашивании плода для анализа используют околоплодные воды и клетки плаценты.
Читайте также:  Мезотерапия лица от прыщей

Грамотная подготовка к сдаче биоматериала не представляет для пациентов никаких трудностей. Имеются определенные рекомендации:

  • при анализе на половые инфекции:
  • исключить интимные контакты за 72 часа до сдачи материала;
  • прекратить использование любых вагинальных средств за 3 суток;
  • с вечера предыдущего дня не проводить гигиену исследуемой области;
  • исключить мочеиспускание за 3 – 4 часа при взятии пробы из уретры;
  • прекратить прием антибиотиков за месяц до сдачи анализов на инфекции;
  • кровь сдают утром до принятия еды и питья;
  • сбор первой утренней порции мочи проводится в стерильный контейнер после тщательного интимного туалета.
  • О том, как проводится диагностика по методике полимеразной цепной реакции, читайте ниже.

    Как проходит процедура

    При выполнении исследования ПЦР раз за разом в реакторе (амплификаторе или термоциклере) повторяются определенные циклы:

    1. Первый шаг – денатурация. Слюну, кровь, биоптат, гинекологические пробы, мокроту, в которых подозревается присутствие ДНК (или РНК) патогена, помещают в амплификатор, где происходит нагревание материала и расщепление ДНК на две отдельные цепочки.
    2. Второй шаг – отжиг или небольшое охлаждение материала и добавление к нему праймеров, способных распознавать нужные участки в молекуле ДНК и связываться с ними.
    3. Третий шаг – элонгация – происходит после присоединения 2 праймеров к каждой из цепочек ДНК. В ходе процесса фрагмент ДНК патогена достраивается, и формируется его копия.

    Эти циклы повторяются по типу «цепной реакции», каждый раз приводя к удвоению копий специфичного фрагмента ДНК (например, отрезка, где запрограммирован определенный вирус). За несколько часов образуется множество копий фрагмента ДНК, и выявляется их присутствие в образце. После этого проводят анализ и сравнение результатов с данными базы различных видов патогенов, чтобы определить вид инфекции.

    Про расшифровку результатов и вывод исходя из ПЦР-реакции читайте ниже.

    Расшифровка результатов

    Окончательный результат исследования выдается через 1 – 2 суток после сдачи биологического материала. Нередко – уже в первые сутки после анализа.

    Качественный анализ

    • Отрицательный результат означает, что в веществе, сданном на исследование, следов возбудителей инфекции не обнаружено.
    • Положительный результат означает выявление патогенных вирусов или бактерий в биологическом образце с очень высокой степенью точности на момент сдачи материала.

    Если результат положительный, но признаков активизации инфекции не выявлено – такое состояние организма называют бессимптомным «здоровым носительством». Чаще всего наблюдается при взятии биоматериала из определенного места (цервикальный канал, уретра, полость рта) при вирусных заболеваниях. Лечения в этом случае не требуется, но обязательно постоянное врачебное наблюдение, поскольку существует вероятность:

    • распространения вируса от носителей и заражение здоровых людей;
    • активизации процесса и переход заболевания в хроническую форму.

    Количественный анализ

    Количественный результат определяет специалист конкретно для определенного вида инфекции. На его основании можно оценить степень развития, стадию болезни, что дает возможность оперативно назначить правильное лечение.

    Средняя стоимость

    Цены на проведение полимеразной цепной реакции определяют: вид исследования, сложность идентификации возбудителя, трудность забора биологического материала, вид анализа (качественный или количественный), уровень цен в лаборатории.

    С другой стороны, при исследовании ПЦР можно определить сразу несколько патогенов при заборе одного вида материала для анализа. Это позволяет сэкономить на других лабораторных анализах.

    Ориентировочно, стоимость анализа ПЦР в рублях:

    • гонококк, гарднерелла, трихомонада вагиналис – от 180
    • хламидия трахоматис – от 190
    • папилломавирус – от 380 до 500
    • биоценоз урогенитального тракта у женщин (количественная и качественная оценка микрофлоры) – от 800.

    Еще больше полезной информации в отношении исследования ПЦР содержится в видеосюжете ниже:

    Появление метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) радикально трансформировало биологическую науку с момента его первого появления (Кэри Муллис, 1990). Метод позволил реализовать специфическое обнаружение и наладить производство больших количеств ДНК. ПЦР дала толчок исследованиям в области генетики, таким как «Проект генома человека». В настоящее время этот метод широко используется в клинических и научных исследованиях для генной диагностики и клонирования последовательности НК, а также быстро и с высокой точностью проводить сложные количественные и геномные исследования. Одним из наиболее важных медицинских применений классической ПЦР является обнаружение патогенов. Кроме того, данный анализ используется в судебной медицине. Из-за его широкого использования важно понять основные принципы ПЦР и то, как его использование может быть изменено для обеспечения сложного анализа генов и генома.

    Процесс

    ПЦР представляет собой простой, но элегантный, ферментативный анализ, который позволяет амплифицировать (увеличивать количество копий) специфический фрагмент ДНК из смеси из множества молекул нуклеиновых кислот. Доктор Муллис (Mullis), открывший ПЦР, заявил, что «метод позволяет вам выбрать фрагмент ДНК, который вам интересен, и сделать столько копий, сколько вам нужно» (Mullis, 1990). ПЦР можно проводить с использованием исходной ДНК из различных тканей и организмов, включая периферическую кровь, кожу, волосы, слюну и микроорганизмы. Для ПЦР необходимы только следовые количества ДНК, чтобы генерировать достаточное количество копий для анализа с использованием обычных лабораторных методов. По этой причине ПЦР является очень чувствительным анализом.

    В настоящее время на рынке представлено очень большое количество амлификаторов для ПЦР различных производителей, таких как Thermo Fisher Scientific, Eppendorf, Roche и другие.

    Заказать амплификатор, а также получить консультацию специалистов по подбору оборудования и расходных материалов вы можете на сайте компании Пущинские лаборатории www.laboratorii.com

    Применение в медицине

    В клинической диагностике метод ПЦР получил очень широкое распространение благодаря своей высокой чувствительности а также относительно небольшому (от 20 до 60 минут) времени проведения анализа. Используется он в областях, перечисленных ниже:

    • Онкология.
    • Урология.
    • Гематология.
    • Гастроэнтерология.
    • Пульмонология.
    • Физиатрия и прочие медицинские разделы.

    С помощью ПЦР определяют такие заболевания, как гепатиты C и B, ВИЧ, СПИД, хламидиоз и многие другие. Проводится анализ методом полимеразной цепной реакции на образцах крови.

    Анализ продукта ПЦР

    Существует два основных способа визуализации продуктов ПЦР

    • окрашивание амплифицированного ДНК-продукта химическим красителем, таким как бромид этидия, который интеркалирует между двумя нитями дуплекса или
    • помечая ПЦР-праймеры или нуклеотиды флуоресцентными красителями (флуорофорами) до амплификации.

    Количественная ПЦР

    Количественные данные в реальном времени (qRT-PCR, реал-тайм ПЦР) позволяющие получить дополнительную информацию помимо простого обнаружения определенной последовательности. Реал-тайм ПЦР указывает, какая часть конкретной ДНК или гена присутствует в образце. qRT-PCR позволяет одновременно обнаруживать и количественно определять продукт ПЦР в режиме реального времени, в то время как он синтезируется. Два распространенных метода, используемых для обнаружения и количественного определения продукта, включают флуоресцентные красители, которые неспецифически интеркалируют с двухцепочечной ДНК и последовательно-специфичные ДНК-зонды, состоящие из флуоресцентно меченных последовательностей. Флуоресценция возникает только после гибридизации зонда с его комплементарной ДНК-мишенью. ПЦР в реальном времени можно комбинировать с обратной транскрипцией, которая позволяет превращать РНК в кДНК (обратная транскрипция), после чего количественную оценку кДНК выполняют с помощью qPCR. Количественное определение желаемого гена во время экспоненциальной амплификации позволяет избежать проблем, связанных с конечной точкой ПЦР, которая анализируется после завершения окончательного цикла ПЦР.

    Преимущества и ограничения ПЦР

    Для ПЦР существует несколько преимуществ. Во-первых, это простой для понимания метод, который быстро дает результаты и использования. Во-вторых, это высокочувствительный метод, способный производить огромное количество копий определенного продукта для секвенирования, клонирования и анализа. Это справедливо и для количественной реал-тайм ПЦР, но она имеет преимущество количественного определения синтезируемого продукта. Таким образом, его можно использовать для анализа изменений уровней экспрессии генов в опухолях, микробах или других болезненных состояниях.

    Хотя ПЦР является ценным методом, у нее есть ограничения. Поскольку она является высокочувствительной методикой, любая форма загрязнения (контаминации) образца даже следовыми количествами ДНК может приводить к ошибочным результатам. Кроме того, для разработки праймеров необходимы некоторые данные предварительной последовательности. Поэтому ПЦР можно использовать только для идентификации присутствия или отсутствия известного патогена или гена. Другое ограничение заключается в том, что праймеры, используемые для ПЦР, могут отжигать неспецифические последовательности, которые являются сходными, но не полностью идентичными ДНК-мишени. Кроме того, неправильные нуклеотиды могут быть включены в последовательность ДНК-полимеразой, хотя и с очень низкой скоростью.

    Резюме

    ПЦР представляет собой простой и широко используемый метод, при котором мелкие количества ДНК могут быть амплифицированы в большое количество копий. В дополнение к быстроте, с которой работает этот анализ, он способен количественно продемонстрировать, какая часть конкретной последовательности присутствует. Как и во всех методах, справедливость результатов следует сравнивать со спецификой, связанной с этим методом. Будущее ПЦР является многообещающим, сочетая различные анализы и подходы для лучшего понимания различных комбинаций генов. Например, в исследовании по связыванию отдельных таксонов в микробном сообществе с конкретными метаболическими процессами стабильное зондирование изотопов было объединено с qPCR. Эксперименты с микрочипом могут быть подтверждены подходом qPCR из-за его быстроты.

    Обратите внимание

    Эссенциале форте до или после еды

    Содержание1 Содержание:2 Как правильно принимать Эссенциале® форте Н?3 Что входит в состав Эссенциале® форте Н?4 ...

    Добавить комментарий

    Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

    Adblock detector